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Zusammenfassung des Gesamtprojektes
In den letzten Jahren ist ein massiver Anstieg des Vorkommens von Antibiotika-resistenten Mikroorganismen zu verzeichnen. Dadurch gelangen durch Bakterien verursachte Infektionen wieder verstärkt in den Fokus von Wissenschaft und Forschung. Es besteht daher ein dringender Bedarf zur Entwicklung neuartiger, nicht auf Antibiotika basierender, antibakterieller Therapiestrategien. Einen relativ neuen möglichen Ansatzpunkt bietet die Entdeckung von so genannten „small non-coding RNAs (sncRNAs)“ (nicht kodierende RNAs), deren Funktion als globale Genexpressions-Regulatoren bei Bakterien zunehmend in das Interesse der Forscher gerät. Bisher gibt es maßgeblich Studien zu diesen RNAs in biotechnologisch relevanten Bakterienspezies wie z.B. E. coli.
Die entwickelten Handwerkszeuge zur Identifizierung solcher RNAs und zu deren molekularen Charakterisierung sollen im Rahmen dieses Projektes nun auf einige der wichtigsten und sozi-ökonomisch bedeutsamsten bakteriellen Krankheitserreger übertragen werden. Hierzu gehören die Bakterienspezies Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis und Clostridium difficile.
In all diesen Spezies ist die Funktion von sncRNAs im Rahmen der Pathogenität und Kolonisation vollkommen unbekannt. Durch den Einsatz von Hochdurchsatz-Screeningmethoden, Transkriptom- und Proteomanalysen, sowie neusten bioinformatorischen Analysemethoden hat sich das Konsortium vorgenommen alle in den oben genannten Spezies existierenden und agierende sncRNAs zu identifizieren, zu charakterisieren und ihre Bedeutung für die Pathogenität der Bakterien aufzuklären. Peptid-gekoppelte Nukleinsäuren (peptide nucleic acids, PNAs) die gegen die identifizierten sncRNAs gerichtet sind werden als neuartige Therapiestrategie in der Blockierung der sncRNA Funktion getestet. Solche PNAs können durch ihre Modifikationen in die Bakterienzellen penetrieren und dort über hochaffine Bindungen basierend auf Antisense-Mechanismen die Funktion der sncRNAs ausschalten. Mit den so entwickelten spezifischen PNAs ist die Entwicklung eines mikrofluiden „point-of-care“ Diagnostik-Chip zur schnellen Diagnostik der Bakterien am Krankenbett ebenfalls in Planung. Mit diesem Genom-weiten systembiologischen Ansatz erhoffen sich die Projektpartner bald bessere Diagnosemethoden und auch spezifische Therapiestrategien gegen die Infektionserreger in der Hand zu haben.
Kurzbeschreibung der beiden Teilprojekte aus den Universitäten Rostock und Greifswald
 | Projektpartner 4, PD Dr. Bernd Kreikemeyer, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsklinik Rostock:
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Eine wichtige humanpathogene Bakterienspezies ist Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptokokken, GAS). Weltweit verursachen GAS jährlich 111 Millionen Fälle von Pyoderma und über 600 Millionen Fälle von Pharyngitis. Mindestens 500000 Todesfälle resultieren aus schwerwiegenden und systemisch-toxisch verlaufenden GAS Infektionen, wodurch GAS zu den wichtigsten Gram-positiven Bakterienspezies gehört, die weltweit für signifikante Morbidität und Mortalität verantwortlich sind. GAS können an eukaryote Zellen adhärieren, in diese Zellen internalisieren und in Zellen des Wirtes auch für längere Zeiträume persistieren. Gerade die Fähigkeit zur Adhärenz und Internalisierung ist ein aktuell diskutiertes Konzept welches die häufig auftretenden Fälle von rekurrenten GAS Infektionen, asymptomatischen GAS-Trägern und für lange Zeit im Gewebe persistierenden GAS erklären könnte.
Die detaillierte molekulare Aufklärung der GAS Adhärenz- und Internalisierungsfähigkeit sowie anderer Virulenzmechanismen ist daher der zentrale Forschungsinhalt der Arbeitsgruppe Kreikemeyer. Langfristiges Ziel ist die Entwicklung neuartiger Therapiestrategien unter Verhinderung von Rekurrenz und Persistenz. Zum Erreichen dieser Ziele ist eine detaillierte Kenntnis der Regulationsmechnismen, die letztendlich die Virulenzfaktorexpression steuern, notwendig. Man kann davon ausgehen, dass Prozesse wie Adhärenz, Internalisierung, Persistenz und systemische Ausbreitung an verschiedene Sets von Virulenzfaktoren gebunden sind, welche jeweils Situations- und Umgebungssignal-gebunden exprimiert werden.
GAS können von einem hochvirulenten Stadium, das sie für akute und/oder systemische Infektionen benötigen, zu einem eher unauffälligen und das Immunsystem des Wirtes nicht-alarmierenden Stadium umschalten. Eine durch Umgebungssignale gesteuerte Expression der verschiedenen Virulenzfaktor-Subsets ist also von zentraler Bedeutung für eine erfolgreiche Infektion des Wirtes. Mittlerweile liegen 12 komplette Genomsequenzen von GAS in der NCBI Datenbank vor und bilden eine gute Basis für systembiologische Ansätze zur Identifikation von wichtigen Transkriptionsregulatoren und anderen molekularen Schaltern. In diesen Genomsequenzen finden sich bis zu 30 einzelständige Transkriptionsregulatoren neben mindestens 13 so genannten Zwei-Komponenten-Signaltransduktionssystemen, die die Umgebungssignale detektieren und die Information integrieren. Bisher gibt es keine globalen Untersuchungen zur Präsenz und FUnktion von sncRNAs al seine weitere regulative Ebene in diesem wichtigen humanpathogenen Bakterium. Es ergeben sich daraus folgende wissenschaftliche und technische Arbeitsziele für das Teilprojekt Kreikemeyer:
- Globale Detektion und Identifizierung von S. pyogenes sncRNAs
- Funktionelle Charakterisierung der identifizierten sncRNAs
- Evaluierung der charakterisierten sncRNAs durch Transkriptomik, Proteomik, funktioneller Genomik und in silico-Modellierung der sncRNA abhängigen regulatorischen Netzwerke
- Auswahl geeigneter Virulenz-assozierter sncRNAs als neue “drug targets“ und Inhibierung durch antisense-PNAs in vivosowie Etablierung eines ultraschnellen sncRNA-PNA-Diagnostiksystemes
| Projektpartner 5, Dr. Susanne Engelmann, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt Universität Greifswald
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Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives, humanpathogenes Bakterium, das als harmloser Kommensale die Schleimhäute von 30 bis 50% der Bevölkerung kolonisiert. Daneben kann es aber auch eine Vielzahl von Krankheiten, angefangen von harmlosen Infektionen (Furunkel und Abszesse) bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Endokarditis und Sepsis hervorrufen. Allerdings ist über die molekularen Mechanismen, die bei einer Infektion durch S. aureus ablaufen, bisher wenig bekannt. Um eine Infektion auszulösen, muss S. aureus in der Lage sein, in verschiedene Gewebe einzudringen, im Wirt zu überleben und sich in ausreichender Zahl zu vermehren. Die Zellen des Immunsystems des Wirtes können eine Vermehrung und Adhäsion des Bakteriums verhindern. Allerdings besitzt S. aureus auch ein ausreichendes Arsenal an Virulenzfaktoren, um dem Angriff des Immunsystems zu begegnen. Der Ausgang dieses Kampfes ist abhängig vom Gesundheitszustand und der genetischen Prädisposition des Wirtes sowie von der Virulenz und Anfälligkeit des Bakteriums gegen die Wirtsabwehr.
Die Synthese der Virulenzfaktoren erfolgt in der Regel in Abhängigkeit von der Wachstumsphase. Dabei werden insbesondere zellwandassoziierte Faktoren vorrangig während des logarithmischen Wachstums gebildet, während die extrazellulären Toxine und Proteasen erst in der stationären Wachstumsphase erscheinen. Über Signaltransduktionswege und regulatorische Elemente ist es den Bakterien möglich, physiologische Parameter wie Sauerstoffkonzentration, pH-Wert, Osmolarität und Nährstoffkonzentrationen, eventuell aber auch bestimmte Signale, die vom Wirt ausgehen, zu messen, und als Folge dessen eine differentielle Genexpression auszulösen. Damit sind sie in der Lage, sich schnell an die jeweilige Umgebung während einer Infektion anzupassen. Für S. aureus sind mehrere solcher Regulatoren beschrieben.
Mit der Veröffentlichung der Genomsequenzen zweier S. aureus Stämme im Jahr 2001 war es nun möglich, genomweit nach weiteren Regulatoren zu suchen und diese gezielt zu analysieren. Mittlerweile liegen die Genomsequenzen von 14 S. aureus Stämmen in den Datenbanken vor. Neben regulatorischen Proteinen codieren die Genome auch für eine Vielzahl von kleinen regulatorischen RNAs, deren Vorhersage sehr schwierig ist und deren Anzahl daher nur geschätzt werden kann. Die bekannteste und am besten charakterisierte regulatorische RNA in S. aureus ist die RNAIII. In jüngster Zeit gab es Bemühungen, weitere kleine regulatorische RNAs in S. aureus zu identifizieren. So gelang es, in dem S. aureus Stamm N315 12 solcher RNAs nachzuweisen. Dabei sind fünf im Kerngenom und die übrigen im variablen Teil des Genoms dieses Stammes lokalisiert. Dies kann jedoch nur der Beginn einer intensiven Untersuchung von regulatorischen nicht-codierenden RNAs (ncRNAs) in S. aureus sein und sollte ausgeweitet werden auf weitere S. aureus Stämme. Außerdem fehlen bisher Studien zur Identifikation von Genen, deren Expression durch diese RNAs kontrolliert wird. Ziele des Projektes sind daher:
- Globale Detektion und Identifizierung von ncRNAs in S. aureus mit Hilfe bioinformatischer Vorhersagen und DNA Arrays
- Evaluierung der identifizierten ncRNAs durch detailierte Transkriptionsanalysen
- Identifikation der durch diese ncRNAs regulierten Gene/Proteine
- Funktionelle Charakterisierung der ncRNAs unter definierten Laborbedingungen, in Zellkulturen und in Tiermodellen
- Auswahl geeigneter ncRNAs als neue “drug targets“ und Inhibierung durch antisense-PNAs in vivo sowie Etablierung eines ultraschnellen ncRNA-PNA-Diagnostiksystems
Projektpartner
| Partner 1: Dr. Torsten Hein (Projektkoordinator), Institut für Medizinische Mikrobiologie der Justus-Liebig-Universität Giessen
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| Partner 2: Dr. Maja Rupnik, Abteilung für Mikrobiologie, Fakultät für Medizin der Universität Maribor (Slovenien)
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| Partner 3: Prof. Dr. Axel Hartke, Labor für Umweltmikrobiologie der Universität Caen (Frankreich)
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| Partner 4: PD Dr. Bernd Kreikemeyer, Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Rostock
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| Partner 5: Dr. Susanne Engelmann, Institut für Mikrobiologie der Ernst-Moritz-Arndt Universität in Greifswald
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| Partner 6: Dr. Sonja Vorwerk, Febit Biomed GmbH mit Sitz in Heidelberg
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| Partner 7: Dr. Thomas Hartsch, Genedata Bioinformatik GmbH mit Sitz in Planegg-Martinsried
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Projektdetails
Projektlaufzeit: 02/2009 - 02/2012
Projektträger: PtJ
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Figure 1a: Structural organization of the fas regulon and flanking genes drawn to scale. Black bars represent the identified genes. gltX-L, glutamyl tRNA synthase-like gene, rnpA-L, RNAse P protein-like gene and fasB-X, fibronectin/fibrinogen-binding, hemolytic-activity, streptokinase regulator genes.
Figure 1b: Genes controlled by the FasBCAX system. This TCS appears to act on target genes through the action of a small putative regulatory RNA, fasX . TCSs are marked by rods and ovals (histidine kinases and response regulators, respectively), secreted proteins by dots and surface proteins by rectangles. Red lines, down-regulation; green lines, up-regulation.
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